提到lncRNA、circRNA，大家最先想到的研究热点是什么？lncRNA的cis、trans？还是circRNA的ceRNA？事实上，两种非编码RNA（ncRNA）的另一种共有属性还未被广泛发现，那就是「编码」！
如果你想对环状RNA研究有更多的了解，Get更多的研究技巧，那下面这个免费课程非常适合你！
课程时间：4月14日15:30
课程内容：
1.如何获得circRNA并坚定其存在；
2.如何进行circRNA上下调及设计方法；
3.解析circRNA三大功能机制的特点及研究方法；
4.盘点circRNA研究中常用数据库。
01
非编码RNA「编码」概况
根据许多标准，非编码RNA不太可能编码功能蛋白。这些标准包括缺乏长的ORF，缺乏氨基酸序列保守性和缺乏已知的蛋白质结构域1。由于技术手段受限，长久以来，人们忽视了这些分子编码的短肽对生命活动的影响。
得益于分子技术的发展，Orera2等分析了六种生物的核糖体谱数据，发现lncRNA与核糖体关联达到30~82%（编码为92%），预示着lncRNA存在较大的编码潜力；如人MRI-2（69个氨基酸）刺激DNA双链断裂连接3；人lncRNA-HOXB-AS3可编码长约53位氨基酸的短肽，该短肽而非lncRNA可抑制结肠癌的发生4。
环状RNA（circRNA），同样具有编码短肽的功能。其翻译特性由m6A或者IRES（招募核糖体功能）驱动。Circ-FBXW7表达aa的短肽与胶质母细胞瘤表型相关5；circ-SHPRH表达aa的短肽可起到抑制胶质瘤的发生6；circ-ZNF编码的短肽可控制成肌细胞的增殖7。
一系列的报道预示着，sORFs是一片蓝海有待发掘。那么，如何研究ncRNA的编码特性呢？我们以HOXB-AS3（NCBI登录号NR_）为例为您详解lncRNA-sORF的预测及实验设计过程。
02
lncRNA-sORF预测
1
ORF预测
大部分lncRNA编码的肽段较短、或者一条长链里面包含多个ORF，优先选择ORF较长的研究。打开orffinder预测网站，输入登录号ID或者序列，其他参数默认（参考已发现最小的短肽，目前预测短肽的最小值是24aa），点击「submit」，可看到两条预测结果：
注意只看「strand」为「+」的结果，因为RNA是单链的，编码区不会存在负义链上。网站预测到HOXB-AS3存在两个短肽，分别为53、40个氨基酸，接下来就是进行实验验证。
2
实验设计
针对预测的短肽是否编码，常规是构建过表达载体并在ORF的C端添加标签(荧光或者WB标签)，并需要将翻译起始位点ATG进行突变，以确认翻译的起始位点。具体操作如下：
方法一：针对较长的肽，可采取融合flag直接进行WB，直接将flag插入在全长lncRNA的ORF末端，并设计ATG突变作为对照（文章还设计了只构建编码区作为阳参），随后进行WB实验即可。
方法二：针对短肽，若WB灵敏度不足以检测到，那么采取短肽融合荧光策略较优。方法类似，后续通过荧光的表达即可确认肽是否编码。
03
circRNA预测
得益于circRNADb数据库对收录的circRNA进行了较多的注释，circRNA可以直接查询网站统计好的预测数据。以FBXW7（hsa_circ_）为例，直接在circrnadb数据库查找FBXW7名称，找到对应的circRNA（在circrnadb的ID是hsa_circ_），可以获得数据库预测的IRES（也可以用IRESfinder预测）以及ORF区（同样可以用ORFfinder预测，但是要将序列成环延伸变为线性再进行预测）：
接下来仿照lncRNA的做法，在ORF末端加上标签，进行密码子ATG突变，以及IRES缺失构建环状RNA过表达，进行表达验证：
非编码RNA通常转录活性较低，且由于较短的ORF，同于早前认为lncRNA是转录垃圾，一些科研人员认为大部分短肽是无功能的翻译垃圾。然而研究发现：多数人类特异性编码基因是从猕猴或黑猩猩低表达的非编码RNA进化而来8，这表示在选择压力下，ncRNA编码的肽可作为物种进化时新肽的重要来源2，至于ncRNA表达的肽是否具有更加广泛的生物学意义，还待更多的科学研究！！！
经过一番介绍大家是不是对环状RNA有了更多认识，不如现在就来学习，Get更多实用技能，解决实验过程中遇到的各种阻碍，一路打怪升级，加速科研进展！为此我们特意准备了环状RNA研究和实验的免费课程，现在报名学习，研究快人一步。
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